여러 가지 목적 단백질을 발현, 분리하여 준비된 시료에 얼마만큼의 단백질이 존재하는지 확인하기 위해서는 단백질의 정량이 필수적이다. 적절한 단백질 정량법을 선택하고, 각 방법의 원리를 이해하기 위해 다양한 정량법을 살펴보자.
단백질 정량을 위한 자외부 흡수법
자외부 흡수법은(UV spectrometri method)는 특별한 시약이나 반응 시간, 표준곡선이 불필요한 간단한 정량 방법이다. 이름에서 알 수 있듯이 UV를 이용하는 방법으로, 단백질의 두 가지 특성을 이용한다. 첫 째, 단백질을 구성하는 아미노산 중 페닐알라닌, 트립토판, 티로신과 같이 방향족 아미노산이 280nm에서 흡광도를 갖는다. 둘째, 단백질에서 아미노산들을 연결하는 '펩타이드 결합(peptide bond)'이 200nm에서 흡광도를 갖는다. 흡광도(absorbance)란, 흡수되는 빛의 양을 말하며 분광 광도계(spectrophotometer)에서 일정량의 빛을 쏘아 시료를 통과하여 검출되는 양으로 측정할 수 있다. 그러나 만일 측정하려는 단백질에 방향족 아미노산이 존재하지 않거나 260nm의 최대흡광도를 갖는 DNA처럼 비슷한 파장에서 흡광도를 가지는 물질이 있을 경우 정확한 단백질 농도 측정이 어렵다. 세포에서 분리한 단백질을 좀 더 정확하게 구하기 위해, 정량에 가장 크게 영향을 주는 DNA 오염의 상관관례를 수식화하여 [단백질 농도(㎎/㎖)=(1.55 X 280 흡광도)-(0.76 X 260 흡광도)]의 공식이 도출되었다. UV를 통한 정량은 시약과의 반응을 사용하지 않고, 시료를 직접적으로 측정하므로 회수가 가능하다. 때문에 앞 포스팅에서 다루었던 HPLC(High-Performance Liquid Chromatography) 등 자동화된 장비에 장착되어 검출에 활용된다.
Bradford assay와 표준곡선
이 방법은 처음 방법을 만든 Marion M. Breadford의 이름에서 명명되었다. 가장 많이 사용되는 정량법 중 하나로, Commassie brilliant blue G-250 (이하 Commassie blue)라는 단백질의 결합에 따른 흡광도 변화 특성을 이용한다. Commassiie blue는 붉은색을 띠며 456nm에서 최대 흡광도를 갖지만, 산성 조건 하에서 염기성/방향족성 아미노산 곁사슬에 결합하면 푸른색으로 변하며 최대 흡광 파장이 595nm로 변화된다. 595nm에서의 흡광도는 commassie blue에 결합된 아미노산 양에 비례하고, 이는 곧 단백질의 농도를 의미한다. 단백질과 commassie의 결합을 통한 발색은 2분 내로 발생하며, 발색 안정성은 1시간가량 유지된다. 따라서 이 정량법을 수행할 때에는 1시간 내에 측정을 완료하는 것이 좋다. 측정값으로부터 농도를 구하기 위해서는 표준곡선이 필요하다. 표준곡선은 BSA(Bovine Serum Albumin)와 같이 고순도로 분리된 단일 단백질을 사용한다. 여러 농도의 표준 단백질을 각각 동일한 양으로 준비하고, Commassie blue와 반응하여 농도별 흡광도값으로 표준곡선을 작성한다. 이후 농도를 구하려는 시료를 사용된 표준 단백질과 동일한 양으로 반응시켜 측정된 흡광도 값을 표준곡선에 대입하여 농도를 구한다. 흡광도를 측정하는 방법이므로 자외부 흡수법과 마찬가지로 분광 광도계가 사용된다. 분광 광도계로 흡광도를 측정할 때, 한계값에 이르면 더 많이 흡수하더라도 수치의 유의미한 차이를 갖지 않는다. 따라서 고농도 단백질 시료의 농도를 측정할 때는 적절한 희석을 거쳐 표준곡선에서 농도를 구한 뒤, 희석 비율을 곱해서 최종 농도를 얻는다.
Lowry-Folin 외 여러 정량법
또 다른 단백질 정량 방법으로, 단백질의 펩타이드 결합과 Cu2+이온 간의 복합체 형성으로 Cu가 환원되며 유도되는 발색반응을 이용한 Lowry-Folin 정량법이 있다. Lowry-Folin 정량법은 Bradford assay와 함께 가장 많이 사용되고 있는 정량법 중 하나이다. Cu2+이온이 단백질의 펩타이드 결합과 복합체를 이루면서 Cu1+와 단백질의 트립토판, 티로신 아미노산이 라디칼(radical)을 형성하는데, 이 라디칼 그룹이 노란색의 Folin-Ciocalteu 시약을 환원시켜 진한 청색으로 변화시킨다. 색의 변화는 단백질 농도에 비례하며, 750nm에서 흡광도를 측정한다. Bradford 법과 마찬가지로 표준곡선이 필요하다. Lowry 법은 검출 감도가 높은 편이며 아미노산 조성에 영향을 적게 받는다. 그러나 반응속도가 느리고 정량을 위해 사용되는 carbonate 시약이 불안정하여 사용 직전에 제조해야 한다. 그 외에도 알칼리 조성에서 Cu2+이온과 단백질의 질소 간의 결합으로 생성되는 화합물의 흡광도를 측정하는 Biuret 법, Lowry 정량법의 Folin 시약 대신 BCA(Bicinchoninate)를 사용하는 BCA 정량법 등이 있다. Biuret 법은 단백질을 구성하는 아미노산 조성에 큰 영향을 받지 않는다는 장점이 있지만, 감도가 낮아 비교적 높은 농도의 단백질을 정량할 때 사용되는 방법이다.
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