이전 글에서 크로마토그래피에 대해 간단하게 알아보았습니다. 이번 포스팅에서는 흡착 크로마토그래피의 한 종류인 '이온 교환 크로마토그래피'의 원리를 이해하고, 이를 이용한 물질의 분리 방법에 대해 다뤄보도록 하겠습니다.
이온 교환 크로마토그래피
이온 교환(Ion-exchange) 크로마토그래피는 이온 교환체와 이온성을 띠는 시료 사이의 가역적인 전기적 상호작용(electrostatic interaction)을 이용하는 흡착 크로마토그래피의 일종입니다. 이온 교환체(Ion-exchanger)는 전하를 띠는 functional froup을 가진 고체 지지체(support)입니다. 이온 교환 크로마토 그래피는 교환체를 컬럼(columm)에 충전하여 수행하며, 이온 교환체는 완충 용액 내에 존재하는 반대 이온과 결합하고 있습니다. 이때 시료 물질들과 혼합되면, 완충용액에 존재하던 반대 이온을 대신하여 시료 물질이 교환체와 결합을 하게 됩니다. 교환체와 결합하지 못한 물질들은 컬럼 아래로 빠져나갑니다. 전기적 상호작용을 이용하는 방법이므로, 분리하고자 하는 목적 물질이 어떤 전하를 띠고 있는지 이해해야 하며, 그 물질을 붙잡기 위한 이온 교환체를 선택하고 사용하는 가장 중요한 포인트입니다. 결합의 세기는 시료 물질의 전하 크기, 밀도 등에 따라 달라집니다. 교환체와 시료의 결합은 가역적이므로, 완충 용액 내의 이온 농도를 점차 높여주면 교환체와의 결합력이 약한 물질부터 교환체와의 결합이 끊어지며 컬럼 아래로 용출됩니다.
이온 교환체의 종류 및 선택
Ion-exchanger는 어떤 전하를 띠는 물질을 붙잡을 것인지를 결정하는 중요한 요소입니다. 이온 교환체 dextran, agarose, cellulose, polystyrene, polyphenolic resin 등의 불활성 매트릭스에 전하를 띠는 작용기가 붙은 물질입니다. 교환체는 붙어있는 작용기의 전하에 따라 음이온 교환체(anion exchanger)와 양이온 교환체(cation exchanger)가 있으며, 음이온 교환체는 +전하를 띠고, 양이온 교환체는 -전하를 띱니다. 명칭과 전하가 혼동되기 쉬우나, 무엇을 붙잡는지를 생각하면 이해하기 쉽습니다. 음이온 교환체는 음이온을 붙잡아서 분리(시료의 교환)를 해주는 물질이므로 음이온을 붙잡기 위한 +를 띠고 있습니다. 반대로 양이온 교환체는 양이온 물질을 붙잡으므로 -전하를 띠고 있습니다. 이온 교환체는 결합된 작용기의 이온화 세기에 따라 강이온(strong ion-exchanger)과 약이온(weak ion-exchanger)으로 나뉘며, 작용기의 종류에 따라 강산성 양이온 교환체, 약산성 양이온 교환체 또는 강염기성 음이온 교환체, 약염염기성 음이온 교환체로 구분됩니다.
Ion-exchange의 주의사항
강이온 교환체를 사용할 경우 물질과 강하게 결합이 이루어지기 때문에, 교환체와 결합된 목적 시료 물질을 떼어내어 용출하기 위해서 이온 세기나 pH의 변화가 커야 합니다. 그러나 약이온은 비교적 적은 이온 세기와 pH의 변화로 용출이 가능합니다. 따라서 목적 물질이 이온의 세기 및 pH에 영향을 받는지를 파악하고, 물질이 안정한 pH를 선택하여 그에 따라 적절한 이온 교환체 및 용출 buffer를 결정해야 합니다. 기본적으로 이온 교환체의 선택은 분리하려는 목적 물질의 전하에 따라서 달라집니다. 분리하려는 물질이 -또는 + 의 단일 전하를 가진다면 그에 맞는 이온 교환체를 선택하는 것이 명료하지만, 많은 생체 화합물들은 양전하와 음전하를 모두 가집니다. 두 전하를 모두 가지는 물질들의 알자 전하(net charge)는 pH에 따라 달라집니다. pH에 따라 물질이 어떤 전하를 띠는지를 이해하기 위해서는 등전점(pI: isoelectric point)을 알아야 합니다. 등전점이란 양전하와 음전하를 모두 지닌 분자가 전체의 전하 합이 0이 되는 pH값을 의미합니다. 등전점보다 pH가 높은 조건에서는 물질의 알짜 전하가 -를 띠고, 등전점보다 높은 pH 조건에서는 알짜 전하가 +를 띱니다. 따라서, 크로마토그래피를 수행할 완충용액의 pH에서 해당 물질이 어떤 전하를 띠는지 이해하고 적합한 교환체를 선택해야 합니다.
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