위의 사진은 단백질 시료를 SDS-PAGE 후, 염색 시료로 단백질을 염색하여 얻은 결과이다. 전기영동 과정을 거쳐 단백질들이 크기에 따라 분리되어 각각의 선을 보인다. 이러한 결과를 보이는 원리를 이해해 보자.
전기영동(Electrophoresis)
전기영동은 이전 글에서 한 번 간단하게 다룬 적이 있지만, 해당 글은 유전자를 다루는 것에 초점이 맞추어져 있었기 때문에 단백질의 분리에 대해서는 알아보지 않았다. 유전자 분석을 위한 전기영동과 단백질의 전기영동이 진행하는 방식에는 약간의 차이가 있을 수 있지만, 기본적인 원리는 동일하다. 전기영동은 전하를 가지는 물질이 전기장 내에서 반대의 전하 방향으로 향하는 것을 이용하여 물질을 분리, 분석한다. 물질의 이동은 전기장에 흐르는 전류의 세기와 분리되는 물질의 크기, 모양 및 전하량 등의 특성에 영향을 받는다. 흐르는 전류가 셀 수록, 물질이 갖는 전하량이 클수록 이동 속도는 빠르다. 그러나 물질의 크기나 모양에 따라 마찰 계수가 결정되며, 이동 속도는 마찰계수에 반비례한다. 물질은 지지체를 통과하며 이동하는데, 종이나 얇은 젤이 지지체롤 사용된다. 단백질과 같은 고분자 화합물을 적용에는 주로 폴리아크릴아마이드(polyacrylamide) 젤을 이용한다. 지지체들은 그물 구조로 구성되어 있으며 지지체의 밀도가 높을수록 더 세밀한 그물 구조가 형성되어 작은 크기의 분자를 구분하는 데에 더 유용하다. 단백질의 전기영동을 위한 젤을 만드는 방법 및 전기영동 준비하는 과정 등은 아가로즈 젤을 사용하는 유전물질의 전기영동과 상당 부분 유사하니 참고하면 좀 더 쉽게 이해할 수 있을 것이다.
PAGE gel
PAGE는 폴리아크릴아마이드 젤을 이용하는 전기영동 방법으로 Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis의 축약어이다. 폴리아크릴아마이드 젤은 아크릴아마이드(acrylamide)와 비스아크릴아마이드(N,N'-methylene-bis-acrylamide)의 중합 반응에 의해 만들어지며, 중합 반응 개시를 위한 ammonium persulfate와 촉매 역할을 하는 TEMED가 사용된다. 아크릴아마이드와 비스아크릴아마이드의 농도, 비율에 따라 만들어지는 젤 내의 구멍 크기를 조절할 수 있다. PAGE는 사용하는 polyacrylamide gel의 형태에 따라 컬럼형과 슬랩(slab)형으로 실행한다. 컬럼형은 유리관에서 젤을 굳혀서 만들며, 젤 위에 시료를 적재하므로 하나의 컬럼에 한 시료만 적재할 수 있다. 슬랩형은 유리 판 사이에서 콤(일정한 간격의 빗 모양 도구)을 끼워 제작되므로 콤을 제거한 뒤에 일정한 간격으로 생기는 여러 개의 빈 공간에 각각 하나씩의 시료를 넣을 수 있으므로 한 젤에서 여러 시료를 동시에 분리할 수 있다. 전기영동을 시작하면 음전하를 띠는 단백질들은 크기 및 전하량에 따른 이동 속도의 차이로 서로 분리된다. 분리능을 향상 시키기 위해, 하나의 젤에서 젤의 농도와 pH를 달리하여 stacking gel과 resolving gel 부분으로 구성이 구분되는 것을 discontinuous gel이라고 한다. Disc gel의 stacking gel은 농도가 낮아 구멍이 크므로 단백질의 분리는 일어나지 않지만, pH에 따른 완충 용액 속 이온의 전위차로 인한 이동성에 의해 많은 부피의 단백질 시료가 얇게 압축된다. 따라서 resolving gel 부분으로 넘어가며 분리가 시작될 때, 시료가 적재된 부피와 관계없이 동일선상에서 분리되므로 분리능이 향상된다.
SDS-PAGE
PAGE를 진행할 때 음이온성 세제인 SDS(sodium dodecyl sulfate)를 사용하는 방법을 SDS-PAGE라 한다. 시료를 적재하기 전에 SDS와 환원제를 가하고, 가열처리를 하여 단백질을 변성시킨다. 변성된 단백질은 linear polypeptide chain의 형태로 존재하게 되어 구조의 영향을 받지 않게 된다. SDS가 단백질의 소수성 부위와 일정한 비율로 결합을 하므로, 모든 단백질들의 전하량/질량 비율이 일정해진다. 따라서 오직 크기에 따라서만 분리된다. SDS-PAGE는 젤에도 SDS가 포함되며, 시료 적재를 위한 loading dye, 전기영동 전개 완충 용액 등 모든 과정의 구성에 SDS가 포함된다. 단백질을 변성시켜서 진행하므로 denaturing electrophoresis라고도 부른다. 그러나 단백질의 천연 구조를 유지한 채 분석을 진행하는 경우에는 SDS-PAGE를 할 수 없으므로, SDS가 포함되지 않은 젤 및 버퍼 등을 사용하여 Native PAGE를 수행해야 한다. SDS-PAGE는 염색 염료를 사용하거나 형광 염료를 사용하여 단백질을 검출할 수 있으며, 젤 상에서 분리된 단백질은 하나의 선으로 나타난다.
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