앞선 3개 글에서 크로마토그래피가 무엇인지와 몇 가지 크로마토그래피의 종류에 대해 다루었다. 여러 물질이 혼합된 시료에서 목적 물질만을 분리해 내는 것은 상당히 중요하다. 특이적 결합으로 높은 분리능을 갖는 방법 중 하나인 친화 크로마토그래피를 알아보자.
친화 크로마토그래피란?
이온 교환이나 젤 거름 크로마토그래피 등 여러 가지 크로마토 그래피 방법들은 알짜 전하의 크기나 질량 등의 특성을 이용하여 시료 물질을 분리할 수 있으나, 명확하게 원하는 목적 단백질만을 분리할 수는 없다. 친화 크로마토그래피 (Affiinity chromatography)의 가장 큰 특징은 원하는 목적 단백질에만 작용하는 특이적인 결합을 사용하여 분리한다는 것이다. 이러한 결합에 항원-항체의 결합, 효소-기질의 결합, 수용체-리간드 등의 결합이 활용된다. 이때 대상 단백질에 특이성을 부여하기 위해 특정한 펩타이드나 단백질을 융합시키는데, 이를 어피니티 태그 (affinity tag)라고 한다. 태그를 붙잡을 수 있는 부분이 부착된 아가로즈나 polyacrylamide 등의 고체를 고정상으로 사용하는데, 고정상은 통과하지 못하는 컬럼에 loading 하면 고정상과 결합하지 못하는 물질은 컬럼을 통과하여 용출된다. 어피니티 택을 탐지하여 분리할 수 있는 다양한 시스템과 제품이 상용화되어 있다. 때문에 유전자 재조합 기술을 통해 발현한 융합 및 재조합 단백질을 용이하게 분리, 정제할 수 있으며 다른 크로마토그래피를 통한 분리 방법에 비해 높은 분해능을 갖는 방법이다.
His-tag과 Ni-NTA
활용되는 다양한 affinity tag 중, His-tag이라는 태그가 있다. 이 태그는 6개 혹은 8개의 히스티딘(Histidine, H)이 나열된 것을 말한다. 원하는 대상 단백질을 발현하기 위해 해당 유전자의 말단에 6개(8개)의 뉴클레오타이드 시퀀스(CAT, CAC)를 연결하여 발현한다. His-tag은 Ni-NTA(Nitrilotriacetic NTA로 고정된 니켈)과 결합한다. Ni-NTA에 생체 혼합물을 넣어주면 His-tag이 존재하는 단백질만 결합을 이루게 되고, 결합하지 못한 단백질은 컬럼에서 머무르지 못하고 흘러나오게 된다. (Ni-NTA bead는 크기가 크므로 컬럼을 통과하지 못한다). 목적 단백질과 Ni-NTA 사이의 결합은 이미다졸(imidazole)로 떼어낼 수 있으며, Ni-NTA로부터 결합이 떨어진 단백질을 컬럼을 통과하여 용출된다. His-tag은 태그가 작아 기존 단백질의 기능에 미치는 영향이 작으며, PCR을 통해 태그를 붙이는 것이 간단하다. 또한 단백질의 변성 상태에서도 분리가 가능하다. 그러나 자연에 존재하는 히스티딘 단백질로 인해 비특이적인 결합이 상대적으로 많이 나타나는 편이므로, 정제 후에도 일부 단백질들이 잔존하는 경우가 많다.
그 외 기타 태그
His-tag 이외에도, GST(Glutation S transferase, 글루타치온 전이 효소), 특정 펩타이드(Flag, Myc 등), 말토스 결합 단백질 등의 친화 태그들이 활용된다. GST는 글루타치온에 특이적인 결합을 하는 효소로, 목적 단백질 유전자에 GST 유전자를 재조합하여 발현한 뒤, 글루타치온이 붙은 resin을 통해 분리한다. 이 방법은 높은 선택성을 갖지만 25 kDa이라는 상대적으로 큰 tag을 붙여야 하므로 재조합 목적 단백질의 발현 수준이 낮을 뿐만 아니라, 기존 구조 및 활성에도 영향을 줄 수 있다. 같은 원리로 말토스 결합 단백질을 붙여서 발현한 재조합 단백질은 아밀로스(amylose)가 결합된 resin을 통해 분리할 수 있다. 말토스 결합 단백질은 크기가 270 kDa으로 매우 커서 목적 단백질의 기존 특성에 큰 영향을 미칠 수 있지만 재조합 단백질을 수용성으로 발현 유도하는 데 용이하다는 장점이 있다. Flag, Myc 등의 일부 태그는 앞서 살펴본 His-tag과 같은 펩타이드 태그로, PCR 과정으로 쉽게 태그를 붙일 수 있다. 그러나 his-tag과 달리 항체와의 결합 반응을 이용한다. Flag과 Myc , Ha tag 등은 항원에서 항체가 특이적으로 결합하는 부분(epitope)의 아미노산 서열 단편이다. 항원-항체 반응은 결합 특이성이 우수하지만, 항체를 이용하여 시료 물질을 분리하기에는 상대적으로 많은 비용이 든다. 그 외에도 인틴/키틴 결합 도메인 등의 방법이 있다.
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