1928년, 독성을 나타내지 않는 폐렴구균과 열처리로 활성을 잃은 독성 폐렴구균을 혼합 시 독성을 나타내는 현상이 발견되었다. 이후 박테리아의 내부로 DNA가 유입되어 '형질전환'이 일어난다는 사실이 밝혀졌다. 앞서 살펴본 DNA 가공 과정 후, 이를 발현시키기 위해 Transformation 과정을 거친다.
형질전환이란?
형질전환(Transformation)의 고전적 의미는 '외부 DNA가 bacteria 내부로 유입되어 발현됨으로써 박테리아의 형질을 변화시키는 현상'이다. 박테리아는 자연적으로 외래 DNA를 유입할 수 있다. 박테리아가 외부 DNA를 세포 내로 유입시킬 수 있는 능력은 분자 생물학의 기반이 되는 기술로서 활용된다. 자연계에서 관찰 가능한 박테리아의 자체적인 transforamtion 효율은 극히 낮으므로, 이를 그대로 이용하기보다는 형질전환 효율을 높일 수 있는 여러 인위적인 방법들이 개발되었다. DNA가 강한 -전하를 띠고 있는 고분자이므로, 세포막을 바로 통과하는 것은 불가능한 일이다. 때문에, -전하에 대한 전기적인 반발력을 완화하도록 세포에 물리적, 화학적인 처리를 하거나 전기자극법 (electroporation) 또는 미세주입법(micro-injection) 등의 방법을 사용하여 DNA를 유입 효율을 높인다. 많은 실험실들에서 Plasmid DNA의 증폭, 유전자 재조합 또는 재조합 단백질 다량 생산 등의 목적으로 형질전환을 활용하고 있다.
Comp cell 제작과 DNA 전달 원리
Comp cell (Competent cell. 수용 세포)란 외래 DNA를 받아들일 수 있는 상태의 세포를 의미한다 (Competency). 자연계의 박테리아는 형질 전환에 관련된 여러 단백질들에 의해 competency가 조절된다. 그러나 연구에서는 기능을 높이기 위해 bacteria에 인위적인 물리적, 화학적인 처리를 통해 외부 DNA가 세포 내로 쉽게 들어갈 수 있는 상태로 만들어준다. comp cell을 만들기 위해, 전하 반발력을 완화시켜야 한다. 대장균의 세포막에는 -전하를 띠는 디아실글리세롤(diacylglycerol)이 존재한다. DNA도 같은 -전하를 가지므로 세포막과 DNA 사이에 반발력이 생겨서 DNA가 세포막 근처에 위치하기 어렵다. 때문에 대장균에 +이온을 처리하면 세포막과 DNA 간의 반발력을 중화시켜 DNA가 쉽게 세포막에 근접할 수 있게 된다. 이때 주로 Ca2+ (또는 Rb2+) 이온이 이용된다. 이 2가 양이온은 또한 세포막의 고유한 전기적 성질을 변화시키며 막 구조를 불안정화시킨다. 불안정해진 세포막 구조가 외래 DNA의 유입을 더 용이하게 만든다. 수용세포를 만들 때에는 항상 4도가량의 저온을 유지해야 한다. 낮은 온도에서는 세포막의 인지질 유동성이 감소하므로, 세포막의 전하 배치가 안정화된 상태에서 양이온이 처리되어야 세포막 주위에 고르게 분포할 수 있게 된다.
형질전환 방법
형질전환은 원형의 plasmid DNA 상태로 넣어주어야 한다. Ligation 등의 가공 과정을 거쳐서, 원하는 유전 정보가 포함된 plasmid를 준비한다. 이 plasmid DNA (1 또는 10ng)과 제작된 수용세포를 잘 혼합하여 얼음에서 20~30분가량 유지한다. 그다음, 42도로 유지된 항온 수조 (또는 heat block)에 60초 동안 넣어 열 충격(heat shock)을 주고 곧바로 다시 얼음에 넣어준다. 순간적인 열처리로 세포막의 내/외부 사이에 온도 변화가 생기며, 이 온도 변화로 인해 세포막 부근에 위치하던 DNA가 세포 내부로 빨려 들어갔고, 이후 곧바로 얼음에 넣어줌으로써 세포막의 유동성을 감소시켜 유입된 DNA가 다시 나가지 못하도록 해준 것입니다. 이제 박테리아의 안정화(회복)를 위해 LB를 넣고 37도 배양기에서 넣어 1시간을 유지한다. 원심분리를 통해 LB 배지와 Cell을 분리하고, cell은 넣어준 plasmid의 selection 항생제가 포함된 agar 배지에 도말(spreading)한다. Agar 배지는 37도에서 12~16시간가량 배양시킨다. 형질전환이 일어나서 준비한 plasmid DNA가 유입된 cell은 항생체가 포함된 배지에서 생존할 수 있으므로 cell 콜로니 (colony)를 형성하게 된다.
댓글