이번 포스팅에서는 효소 결합 면역 흡착 분석법(ELSA)에 대해 알아볼 것이다. ELISA는 항원-항체 반응을 이용하여, 검출 항체에 접합된 효소의 활성을 측정하여 시료에 포함된 항원 단백질의 양을 측정할 수 있는 분석법이다.
ELISA의 시료 준비
효소 결합 면역 흡착 분석법(Enzyme-linked Immunosorbent assay)은 약자로 ELISA라고 부른다. ELISA는 시료 샘플에 포함된 특정 항원 단백질의 정량적 분석을 위해 가장 널리 사용되는 방법이다. 항원과 항체의 특이적 결합을 기반으로 하는 기술임으로 분석하려는 대상에 대한 특이적인 항체가 존재하거나 혹은 분석 대상이 생체 면역반응을 통해 항체 생성을 유도할 수 있는 물질이어야 한다. ELISA 분석은 세포 배양액이나 세포 추출물, 혈액 성분 등 다양한 생체 시료에 사용된다. 높은 특이성을 가진 항체를 사용하여 시료에 포함된 표적 단백질의 선택적 검출아 가능하지만 시료 종류에 따라 background가 높게 나타나 결과에 영향을 줄 수 있다. 때문에, 시료에 포함된 물질 중 분석 대상이 아님에도 결과에 영향을 줄 수 있는 기타 성분들을 최소화하는 것이 필요하다. 예를 들어, 검출 시료로 세포 배양액을 이용하는 경우에는 혈청이 없는 배지를 사용하여 혈청 성분을 최소화하고, 혈액 성분의 경우에는 전혈(whole blood, 혈구 세포를 포함하여 혈액의 모든 성분이 포함된 것), 혈장(plasma, 전혈에서 혈구 세포를 제거한 것), 혈청(serum, 전혈에서 혈구와 혈액 응고 성분을 제거한 것)으로 나누어 적절한 시료를 사용한다. 재조합 단백질 등 단백질 시료를 사용하는 경우에는 목적 단백질만 분리/정제하여 사용하는 것이 좋다.
ELISA의 종류
항원을 검출하는 방식에 따라 ELISA를 크게 3종류로 나눌 수 있다. 먼저 Direct ELISA는 항원 단백질을 immunoplate(단백질을 부착할 수 있도록 표면에 특수 처리가 된 plate)에 먼저 결합시킨 뒤 효소가 접합된 검출 항체가 항원에 직접적으로 결합하여 검출하는 방식이다. 이 방법은 다른 ELISA 분석법과 비교하여 가장 간단한 방법이다. 항원에 대한 항체를 한 종류 사용하기 때문에 높은 특이성을 갖는 항체에 적용하기 적합하다. Indirect ELISA는 Direct ELISA와 마찬가지로 immunoplate에 항원 단백질을 먼저 결합시키지만, 1차 항체가 항원에 특이적으로 직접 결합을 하고, 효소가 접합된 검출항체는 2차 항체로써 항원에 결합된 1차 항체에 결합하여 검출되는 방법이다. 이 방법은 2차 항체를 이용하기 때문에 2차 항체가 1차 항체를 재선별하는 과정에서 특이성이 증가된다. 또한 1차 항체에 2개 이상의 2차 항체가 결합하는 경우, 2차 항체의 효소 반응 검출 반응 신호의 증폭이 발생한다. 때문에 direct ELISA보다 특이성과 검출 민감도가 높아진다. Sandwich ELISA 방법은 항원에 특이적인 항체를 먼저 붙인다. 이후 항원을 처리해 주면, 이 항체가 항원 단백질을 붙잡기 때문에 plate에 붙이는 항체를 포획항체(capture antibody)라고 부른다. 다음으로, 항원에 특이적이며 효소가 접합된 검출 항체(Detectopm antibody)를 처리해 주어 (포획항체에 붙어있는) 항원에 결합한 검출 항체의 효소 반응을 측정한다. Indiret ELISA 방식처럼 2개의 항체가 사용되지만, 2개의 항체가 모두 항원에 결합하는 항체이며 각각 항원의 다른 부분(epitope)에 결합해야 한다. 항원에 특이적인 2개의 항체를 사용하여 항원 선별이 2번 이루어지므로 세 가지 방법 중 항원 검출 특이성이 가장 높으며, 각 단계를 통해 신호 증폭이 발생해 감도도 증가한다.
검출 효소의 기질 발색 반응
위의 내용에서 Direct ELISA의 항체, Indirect ELISA의 2차 항체, 그리고 Sandwich ELISA의 검출 항체를 말할 때 "효소가 접합된" 항체라고 표현했다. 항체에 어떠한 효소가 붙어있기 때문에, 그 효소가 기질과 얼마나 반응하는지를 통해 결합된 항체의 양을 확인한다. 항체에 접합되는 효소는 주로 HRP(Horseradish peroxidase)와 AP(Alkaline phosphatase)이다. HRP는 hydrogen peroxide를 사용하여 TMB를 산화시켜 발색시키거나, luminol 등의 화학 발광 기질을 산화시켜 발광시킨다. 기질로 TMB를 사용하는 경우는 청색으로 발색되며, HCL이나 sulfuric acid를 stop solution으로 첨가하면 노란색으로 바뀌며 450nm에서 흡광도를 측정한다. AP의 주된 발색 기질은 주로 pNPP로, 노란색으로 발색하며 405nm에서 흡광도를 측정한다. AP는 HRP에 비해 비교적 안정적이지만 산성 pH나 EDTA, phosphate에 의해 효소 활성이 저해되기 때문에 일반적으로 많이 사용하는 PBS 버퍼를 사용할 수 없다. HRP는 AP에 비해 분자량이 작아서 항체 결합 비율이 높으며 구조적인 방해가 적고, sodium azdie에 활성이 저해된다. 시료 중에 peroxidase나 AP에 대한 활성을 갖는 효소가 있는 경우는 background를 높일 수 있으므로, 검출 항체를 사용하기 전에 시료에 포함된 효소를 불활성화시키거나, 영향을 받지 않는 효소가 접합된 검출항체를 사용해야 한다.
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