고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)는 감도가 좋으며 정확한 분석이 가능하다. 자동화가 되어있어 여러 혼합물들을 분리, 정제가 용이하고 분리된 물질의 분석까지도 가능하다. HPLC의 원리와 기기 명칭, 기능 등에 대해 간단하게 살펴보려 한다.
HPLC의 이론
HPLC는 고성능 액체 크로마토그래피(High Performance Liquid Chromatography) 또는 고압 액체 크로마토그래피(High Pressure Liquid Chromatography)라고 한다. 액체 크로마토그래피 기법으로, 혼합된 시료가 컬럼 내부에서 액체 이동상과 고체 정지상 사이를 흐르면서 단일 물질로 각각 분리된다. 액체 크로마토그래피의 경우 이동상의 속도가 늦어 긴 분석시간과 다양한 컬럼으로 인해 일관적이지 않은 결과를 보일 수 있다. 이러한 단점을 보완하기 위해 컬럼의 표준화 및 고압 펌프의 개발이 이루어졌고, HPLC는 이를 적용한 방법이다. 지름이 작은 표준화된 컬럼을 사용하므로 정량 및 정석적 분석이 가능할 뿐만 아니라, 펌프가 적용되어 고압에서 일정한 속도로 이동상을 흘려보내주므로 다른 크로마토그래피보다 빠르게 수행할 수 있다. HPLC는 기기화, 자동화가 되어 분석 수행이 간편하고, picomole의 아주 소량의 시료도 분석이 가능하다. 컬럼을 거치며 분리된 성분은 연결된 검출기에서 특성 성질을 기반으로 분석되고, 검출된 분석물은 시간별로 분석 신호를 보여주는 '크로마토그램'이라는 결과 데이터로 변환된다. 크로마토그램은 물질이 분리되어 검출된 피크를 보이는데, 그 물질의 양이 많을수록 높은 피크가 생성된다. 또한, 시료를 주입한 후 물질이 분리되어 최대 피크를 나타낼 때 까지의 시간인 '머무름 시간'의 정보도 얻을 수 있다. HPLC는 표준화된 컬럼을 사용하므로, 동일한 수행 조건에서는 특정 물질의 머무름 시간은 일정하다. 크로마토그램을 분석하면 분리된 물질의 머무름 시간으로부터 물질 예측이 가능하고, 최대 피크값으로 해당 물질의 정량이 가능하다.
고성능 액체 크로마토그래피의 종류 구분
크로마토그래피는 동일한 성질을 가진 물질끼리 잘 혼합되는 것, 즉 극성은 극성과, 비극성은 비극성과 친화성이 좋음을 이용하는 방법이다. 정지상과 이동상간의 극성이 다르면 분리하려는 물질은 두 상 사이에서 친화성의 차이로 인해 이동 속도가 달라진다. 이 경우 정지상과 이동상에 사용되는 극성에 따라 정상(Normal phase) HPLC와 역상(Reverse phase) HPLC로 나눌 수 있다. 정상 크로마토그래피에서는 실리카겔 등 극성이 높은 물질을 정지상으로 사용하고, 이동상으로는 극성이 낮은 유기용매를 사용한다. 때문에 낮은 극성의 물질은 정지상보다는 이동상에 친화성을 가지므로, 이동상의 흐름을 따라 먼저 분리된다. 반면 극성이 높은 물질일수록 정지상과의 친화성으로 인해 더 머무르려는 성향을 보이므로 일정하게 흐르는 용매보다 이동성이 저해되어 더 나중에 분리되어 나온다. 역상 크로마토그래피는 정지상으로 C18이나 C8 탄화수소와 같이 극성이 낮은 물질을 사용한다. 극성이 높은 수용액을 이동상으로 사용하여 극성이 높은 물질부터 분리된다. 이러한 역상 크로마토그래피는 사용 가능한 용매가 정상 크로마토그래피보다 다양하며, 분석이 빠르고 용매를 교체할 경우 컬럼의 재평형 시간이 단축된다. 그 외의 방법으로는 이온 교환(Ion-exchange), 분자(Molecular size), 소수성(Hydrophobic interaction) HPLC 등이 있다.
정량 분석 방법
검출할 시료에는 포함되어 있지 않으면서, 시료의 어떤 물질들과도 분리(구분)되고, 이미 알고 있는 물질을 이용하는 "내부 표준법"이 있다. 시료와 표준물질을 여러 개의 농도비로 미리 피크 결과를 각각 얻고, 각 농도비(x)와 피크의 넓이 비율(y)로 정량 곡선을 작성한다. 이후 분석하려는 시료에 농도를 알고 있는 표준물질을 정확한양을 넣어 함께 HPLC를 진행한다. 시료와 표준물질의 피크 넓이 비율로 농도를 구한다. "외부 표준법"은 표준물질을 시료에 가하지 않고, 단독으로 농도별 피크 넓이를 구해 정량 곡선을 작성하여 시료의 넓이로부터 직접적으로 물질의 양을 구한다. 정량 곡선을 작성하기 위한 여러 농도의 표준물질 샘플은 모두 일정한 양으로 주입되어야 하며, 이후 시료의 분석도 동일한 양으로 수행해야 한다. 표준물질과 시료의 검출이 따로 이루어지므로, 검출기가 바뀌면 감도가 다르므로 새로 정량 곡선을 구해야 한다. "표준물질 첨가법"은 시료를 분석한 다음 혼합물에 일정량의 표준물질을 넣어 다시 분석한다. 내부 표준법과 외부 표준법의 장점을 합친 방법이다.
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