Western blot을 진행하기 위해서는 전기영동을 통한 단백질의 분리가 이루어져야 한다. 이전 포스팅에서 다루었던 SDS-PAGE를 진행한 후, 웨스턴 블랏을 진행하는 방법과 검출 원리에 대해 이해해보려 한다.
Western blot
생화학 연구의 일반적인 요구사항 중 하나는 다양한 단백질을 포함하는 혼합 샘플에서 표적 단백질을 구체적/특이적으로 검출하는 것이다. 이를 위해 항원과 항체 결합의 특이성을 이용하여 단백질을 검출하는 기법이 사용되고 있다. 항원-항체의 결합은 꼭 맞는 열쇠와 열쇠구멍 같은 매우 특이적인 결합이다. 웨스턴 블랏은 고체 지지체에 고정되어 있는 단백질들 중에서 항체가 항원으로 인식하는 단백질에만 결합되는 특이성을 통해 단백질을 검출하며, 항원-항체 결합을 사용하기 때문에 Immuno blot이라고도 한다. 표적 단백질에 대한 다클론(polyclonal) 항체와 단일(monoclonal) 클론 항체를 모두 사용할 수 있다. Western blot은 표적 단백질에 대한 특이성이 높을 뿐만 아니라 단백질 검출의 민감도가 전기영동 후의 다른 검출 방법에 비해 훨씬 좋기 때문에 매우 적은 양의 단백질을 검출할 수 있다. 따라서, 웨스턴 블랏은 혼합된 단백질 샘플에서 표적 단백질의 발현 분석 및 정량 분석에 널리 사용된다. Western blot을 수행하기 위해서는 목적 단백질과 결합할 수 있는 항체가 준비되어야 하며, 이 항체가 자연 상태(native)의 항원과 결합하는지 혹인 변성된 항원과도 결합할 수 있는지에 따라 전기영동의 조건을 선택하는 데에 주의해야 한다.
항원-항체
고등 동물의 면역 체계에서, 외래 물질이 체 내로 유입되면 이로부터 스스로를 방어하기 위해 항체(antibody)를 생산하고 이러한 항체의 생성을 유도하는 외래 물질을 항원(antigen)이라 한다. 항원으로는 단백질을 비롯한 핵산, 다당류 등이 다양한 화합물리 작용한다. 항체는 유입된 항원을 매우 특이적으로 인지하지만, 항원의 전체 부분을 인지하는 것이 아니라 특정 부분을 인지한다. 항체가 인지하고 결합을 이루는 항원의 특정 부분을 항원 결정기(antigen determinant)라고 하며 이를 epitope라고 부른다. 대부분의 항원에는 여러 개의 epitope가 있으며, 각 epitope를 인지하는 여러 항체들이 생성될 수 있다. 하나의 항원을 인지하더라도 서로 다른 epitope에 결합하는 항체들은 서로 '다른' 항체이다. 하나의 항원을 인식하는 여러 종류의 항체가 혼합된 항체를 다클론 항체(polyclonal antibody)라고 하며, 이 중 한 종류의 항체만 분리하여 얻은 항체를 단일클론 항체(monoclonal antibody)라고 한다. 웨스턴 블롯과정에서 고체 지지체에 고정된 목적 단백질에 결합하는 항체를 1차 항체라고 하며, 1차 항체의 결합을 검출하기 위해 사용되는 특정 효소가 접합된 항체를 2차 항체라고 한다. 2차 항체는 1차 항체를 항원으로 인식하는 생성된 항체로 1차 항원에 대해서 특이적으로 결합한다.
실험 방법
전기영동을 통해 단백질이 분리된 젤은 PVDF 등의 고체 지지체로 이동시킨다 [transfer]. 젤에 존재하는 -극을 띠는 단백질들이 전류에 흐름에 따라 +방향에 위치한 지지체로 이동하게 된다. Transfer는 100V의 전압에서 1시간 동안 진행하거나, 20V 가량의 낮은 전압으로 over night 진행한다. 열이 발생하는 것을 방지하기 위해 저온실에서 수행하는 것이 좋다. 단백질이 이동된 고체 지지체는 blocking solution에 담가준다 [Blocking]. Transfer를 거쳐 단백질이 고정된 부분 이외의 background에 이후 처리할 항체들이 붙어 비특이적인 결합을 이루지 않도록 skim milk나 BSA와 같은 고순도의 단일 단백질로 빈 공간을 막아준다. Blocking은 약한 shaking을 유지하며 30분에서 1시간 정도 진행한다. 용액을 제거하고 버퍼로 3번 세척하여 지지체에 고정되지 않은 blocking 단백질을 제거한다 [Wash]. 1차 항체 용액을 첨가하고 약하게 shaking을 유지하며 1시간 이상반응하여 항체가 목표 단백질에 결합되도록 한다 [1st antibody]. 이후 용액을 제거하고 버퍼로 3번 세척하여 결합을 이루지 않은 항체를 제거한다 [Wash]. 2차 항체 용액을 넣고 마찬가지로 shaking을 유지하며 1차 항체와 반응시킨 후 [2nd antibody], 동일하게 세척 과정을 거친다 [Wash]. 1,2차 항체 처리 후 세척이 완전히 되지 않을 경우 검출에 영향을 미쳐 비특이적인 결과가 유도될 수 있다. 2차 항체에 접합된 효소를 반응시키고 신호를 검출한다 [Detection].
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